神經(jīng)突觸是大腦中眾多神經(jīng)元之間信息傳遞和存儲的最基本的結(jié)構(gòu)與功能單元。突觸的異常則可能是導(dǎo)致如抑郁癥和阿爾茨海默病等精神與神經(jīng)疾病的起源。精確解析突觸的蛋白分子結(jié)構(gòu)和組織架構(gòu)、及其在神經(jīng)活動或異常過程中的變化是解密大腦奧妙的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是腦科學(xué)與腦疾病研究中最基礎(chǔ)的核心研究方向之一。由于缺乏有效的研究手段，神經(jīng)突觸在很大程度上仍舊是一個“黑盒子”。冷凍電鏡（CryoEM）技術(shù)的快速發(fā)展，一方面使得眾多通過分離純化后的蛋白質(zhì)等生物大分子近原子分辨三維結(jié)構(gòu)得以解析，另一方面，基于最新的冷凍電鏡斷層三維成像技術(shù)（CryoET）能夠?qū)Ρ４嬖诮頎顟B(tài)下細胞和組織樣本進行納米分辨率的三維成像，為在神經(jīng)突觸及其它細胞區(qū)室中原位解析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和組織架構(gòu)帶來了新的契機。

　　2020年11月2日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)、中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院雙聘教授畢國強和劉北明團隊，與美國加州大學(xué)洛杉磯分校周正洪教授合作在Nature Neuroscience雜志上發(fā)表文章Mesophasic organization of GABAA receptors in hippocampal inhibitory synapses，通過發(fā)展前沿冷凍電鏡斷層三維成像技術(shù)，首次解析了抑制性突觸中GABAA受體的原位三維結(jié)構(gòu)，并闡釋了GABAA受體和支架蛋白在抑制性突觸中具有層級化的介態(tài)相分離的組織規(guī)則。

　　畢國強教授多年來著重于發(fā)展用于突觸、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及全腦尺度解析的前沿顯微成像技術(shù)，自從2007年回國后，核心工作之一即是與周正洪教授和匹茲堡大學(xué)章佩君教授開展合作，發(fā)展CryoET原位三維成像技術(shù)，重點應(yīng)用于突觸結(jié)構(gòu)與功能研究。畢國強教授與張小康、陶長路、劉云濤等學(xué)生一起，經(jīng)過長達十年的艱苦攻關(guān)，研發(fā)了新型冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微成像技術(shù)，在國際上開創(chuàng)性地開展了基于冷凍電鏡與關(guān)聯(lián)顯微成像技術(shù)的神經(jīng)突觸超微結(jié)構(gòu)與功能研究，首次利用CryoET解析了完整神經(jīng)突觸的三維結(jié)構(gòu)，并實現(xiàn)了對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中兩類最主要突觸-興奮性與抑制性突觸的精確區(qū)分以及結(jié)構(gòu)特征的定量化分析【1-4】。

　　在此基礎(chǔ)上，研究團隊發(fā)展了一種基于過采樣與自動分類的冷凍電鏡斷層三維成像亞區(qū)域圖像處理方法，實現(xiàn)了對細胞斷層三維重構(gòu)圖像中無標記和無模板依賴的蛋白質(zhì)自動識別和三維重構(gòu)分析。基于這一方法，研究團隊實現(xiàn)了對抑制性突觸中GABAA受體的自動化識別并解析了其19分辨率的原位三維結(jié)構(gòu)，這是目前已報道的首個突觸原位受體蛋白結(jié)構(gòu)。進一步，通過對GABAA受體在突觸中的空間分布進行分析，發(fā)現(xiàn)這些受體在抑制性突觸中呈現(xiàn)層級狀的組織分布特性：GABAA受體之間可以形成具有距離固定（11nm間距）而相對角度可變的雙分子復(fù)合物；這種雙分子復(fù)合物進一步組成具有較低熵并且具備自組織特性的二維網(wǎng)絡(luò)；最后形成具有清晰邊界并介于固、液之間的“介態(tài)”相分離狀態(tài)（mesophasic organization）。通過對GABAA受體的對應(yīng)的胞內(nèi)區(qū)域進行局部亞區(qū)域分類與平均分析和Monte-Carlo模擬分析表明，受體蛋白的這種組織形式可以通過突觸后支架蛋白和受體之間的靈活相互作用而形成。

　　受體分子與支架蛋白的這種半穩(wěn)定性組織分布特征，否定了早期關(guān)于抑制性突觸中受體蛋白規(guī)則錨定在支架蛋白所形成穩(wěn)定的六邊形網(wǎng)格上的推測；另一方面，GABAA受體在相分離邊界內(nèi)相對均勻分布的特性，也不同于基于超分辨光學(xué)成像所發(fā)現(xiàn)的興奮性突觸中受體蛋白具有局部納米域分布的特性。抑制性突觸中受體分子與支架蛋白的這種介態(tài)自組織形式，使得突觸同時具備了穩(wěn)定性和可變性，這一特性從分子組織結(jié)構(gòu)層面很好地解釋了學(xué)習(xí)與記憶的突觸機理。

　　本研究中， GABAA受體原位三維結(jié)構(gòu)的首次解析，為受體蛋白原位高分辨解析以及相應(yīng)藥物作用機理和治療藥物開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)；對抑制性突觸分子組織架構(gòu)的解析表明利用冷凍電鏡斷層成像技術(shù)對突觸這一“黑匣子”的解密邁出了關(guān)鍵的一步。

　　本論文共同第一作者為中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)博士生劉云濤（現(xiàn)美國加州大學(xué)洛杉磯分校博士后）、博士后陶長路（現(xiàn)中科院深圳先進技術(shù)研究院副研究員）和中科院深圳先進技術(shù)研究院正高級工程師張小康，通訊作者為劉北明教授、周正洪教授和畢國強教授。江蘇大學(xué)夏文君副教授完成了其中數(shù)學(xué)建模和計算模擬工作。畢國強教授領(lǐng)銜的團隊依托中國科大合肥微尺度國家研究中心與中科院深圳先進院成立的腦信息研究中心現(xiàn)招聘博士后、研究助理和研究生（包括客座學(xué)生），詳見文末。

　　突觸信號的高效傳遞依賴于突觸后膜致密區(qū)（PSD）獨特的構(gòu)架和復(fù)雜的分子組成。畢國強團隊和周正洪團隊再次聯(lián)手利用冷凍電子斷層成像（CryoET）技術(shù)，在神經(jīng)突觸原位觀察到致密區(qū)中受體和支架蛋白的組織方式，并提供了精準的GABAA受體的結(jié)構(gòu)信息和分布特征 。通過分析膜上受體的分布，該研究進一步指出在抑制性突觸后膜，GABAA受體形成一種有明顯界面的聚集體錨定在突觸后膜上，這種自組裝的GABAA受體聚集體介于無序的液態(tài)和完全有序的固態(tài)之間，和通過液-液相變而形成的聚集體非常吻合。非常有意思的是GABAA受體聚集體所在的膜下面有一層～5納米厚的致密層，作者認為該致密層可能是由支架蛋白gephyrin聚合而成，進而一個由GABAA受體和支架蛋白相互作用、通過液-液相變而形成抑制性突觸后膜致密區(qū)（iPSD）的模型躍然紙上。這種通過相變自組裝方式能使膜上受體相對穩(wěn)定地集中在致密區(qū)并具有一定的可塑性。

　　關(guān)于相分離的研究是近年來的熱點，然而對其生物學(xué)意義的解答卻受限于復(fù)雜而模糊的分子機制，很多領(lǐng)域更是缺乏直接的體內(nèi)證據(jù)，劉、周、畢團隊的工作非常直觀地呈現(xiàn)了iPSD在神經(jīng)突觸原位存在的方式和形成的機制。無獨有偶張明杰課題組同日在Cell Research雜志上發(fā)表的關(guān)于抑制性突觸后膜致密區(qū)（iPSD）中GlyR/GABAA受體與支架蛋白gephyrin相分離研究的發(fā)現(xiàn)和劉、周、畢團隊的電鏡觀察結(jié)果高度吻合，兩個完全獨立的研究相輔相成、從不同的角度共同揭示了iPSD形成的模式及對膜上受體的動態(tài)富集機制。長久以來，關(guān)于PSD的研究多集中于興奮性突觸，而對抑制性突觸知之甚少。劉、周、畢團隊的工作除了為iPSD形成機制的研究提供了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時也為相分離現(xiàn)象的解析建立了新的技術(shù)手段。

　　離子通道廣泛表達在神經(jīng)突觸膜上，是神經(jīng)信號快速傳遞的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。解析原子/分子分辨率的關(guān)鍵離子通道超微結(jié)構(gòu)一直是神經(jīng)生物學(xué)的前沿?zé)狳c。目前最普遍是利用純化的重組蛋白，采用冷凍電鏡單顆粒成像技術(shù)SPA（Single Particle Analysis），可實現(xiàn)3-5 分辨率。鑒于離子通道組裝及構(gòu)象的多樣性、組織制樣的復(fù)雜性，用透射電鏡看到原位組織離子通道的超微結(jié)構(gòu)依然困難重重。本研究中，中科大畢國強教授、Pak-Ming Lau教授和UCLA周正洪（Z.Hong Zhou）教授合作，利用冷凍電鏡斷層成像技術(shù)Cryo-ET（Cryo-Electron Tomography）與光電聯(lián)合技術(shù)的結(jié)合，通過對培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上抑制性突觸超微結(jié)構(gòu)的精細分析，以比超高分辨光學(xué)成像更高一個數(shù)量級的19 分辨率，成功“正視”了GABAA受體在原位突觸后膜上的三維結(jié)構(gòu)。他們進一步分析了GABAA受體在突觸膜表面的聚集形式、分布網(wǎng)絡(luò)、與突觸后膜支架蛋白相互作用、及與突觸前囊泡釋放之間潛在的偶聯(lián)機制。希望畢國強教授團隊能將開發(fā)的方法應(yīng)用到更多神經(jīng)系統(tǒng)（包括興奮性）離子通道結(jié)構(gòu)的原位解析中，為生理或病理狀態(tài)下離子通道的功能及藥理學(xué)驗證提供理論基礎(chǔ)。值得一提的是，Nature在10月份報道了由英國MRC實驗室Radu Aricescu和Sjors Scheres教授合作發(fā)表的SPA突破性工作，其中將GABAA受體解析到1.7 的超高分辨率【5】。期待在不久的將來，離子通道的研究將SPA、cryo-ET及功能驗證有效整合起來，為突觸傳遞及可塑性的分子機制提供原子分辨率的證據(jù)。

　　PSD（Postsynaptic density，突觸后致密區(qū)）位于突觸后膜，是神經(jīng)突觸的重要組成部分。PSD被認為是在突觸后膜集中和組織神經(jīng)遞質(zhì)受體的超級結(jié)構(gòu)。PSD也用作信號裝置，例如，PSD中的激酶和磷酸酶被激活并從PSD中釋放出來，從而改變位于樹突棘中蛋白質(zhì)的活性，或者被運送到細胞核來影響蛋白質(zhì)的合成。PSD行使著快速、非對稱的信號傳遞功能。由于該區(qū)域匯集了上百種蛋白，在電鏡下，PSD的密度較為明顯，直徑大約為250-500 納米，厚度大約為25-50納米。

　　針對PSD上蛋白組分、功能、結(jié)構(gòu)、分布，及PSD本身形態(tài)的研究一直是神經(jīng)生物學(xué)的熱點。然而，由于PSD的多形性，以及其上蛋白尺寸較小，對其的高分辨成像及結(jié)構(gòu)解析工作一直是個難點。超分辨熒光顯微鏡提供了良好的蛋白定位，但通常只能達到20nm左右的定位精度，加上熒光標記效率的問題仍舊無法達到定量解析PSD的要求；冷凍電鏡可提供高分辨的成像，但由于缺乏特異性標記手段，又難以分辨PSD上面的蛋白分子。因此，解開PSD的謎題，還需要在冷凍電鏡方法上有所創(chuàng)新。

　　A型GABA受體來自配體門控離子通道超級家族，呈現(xiàn)五聚，并以20根穿膜的a-helix錨定在細胞膜上。人源的GABAA受體的五個亞基一般由兩個a基因、兩個b基因及一個g基因編碼，互相結(jié)構(gòu)稍有不同。首個GABAA受體的五聚體結(jié)構(gòu)在2014年由筆者當時在牛津大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)部的同事Paul Miller和A. Radu Aricescu通過晶體學(xué)方法解析至3 【6】。為獲得穩(wěn)定的GABAA受體五聚體復(fù)合物及晶體，Radu幾乎孤注一擲，集中幾乎所有的資源攻關(guān)。經(jīng)歷反復(fù)的失敗并耗盡了所有的經(jīng)費后，終于迎來柳暗花明，該晶體結(jié)構(gòu)當時在神經(jīng)生物學(xué)屆引發(fā)了轟動。那一年也是冷凍電鏡革命的開始。此后，Radu迅速向單顆粒冷凍電鏡技術(shù)轉(zhuǎn)型，并將課題組遷去劍橋LMB。在那里，他一發(fā)不可收拾，使用冷凍電鏡解析了GABAA受體的一系列結(jié)構(gòu)并在頂尖刊物發(fā)表【7,8】。他更是與Relion作者Scheres合作，使用冷凍電鏡單顆粒法將GABAA受體的結(jié)構(gòu)推到了1.7 的驚人分辨率，作為方法學(xué)突破成果發(fā)表在今年10月的Nature上【5】。

　　經(jīng)歷了晶體學(xué)到冷凍電鏡的轉(zhuǎn)換，GABAA受體復(fù)合物結(jié)構(gòu)被愈發(fā)快速的解析，但這些結(jié)構(gòu)均來源于體外表達的重組蛋白，人們對于它在神經(jīng)突觸上的原位結(jié)構(gòu)、分布情況、互作關(guān)系等信息仍然知之甚少。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)畢國強團隊與加州大學(xué)洛杉磯分校周正洪團隊合作，開創(chuàng)性的使用冷凍電鏡斷層成像技術(shù)（cryo-ET）及子斷層圖像平均法（STA）對完整突觸中的PSD區(qū)域進行高分辨三維成像及結(jié)構(gòu)解析，成果揭示了PSD的形態(tài)，并在該區(qū)域確認了GABAAR的19分辨率結(jié)構(gòu)及分布。

　　在該項目中，作者們從大鼠胚胎取得海馬體，并在體外培養(yǎng)。作者們將細胞在金網(wǎng)上生長后使用投入式冷凍裝置制樣，并分別在使用VPP或無VPP的情況下對突觸區(qū)域進行cryo-ET數(shù)據(jù)采集。為分辨不同類型突觸PSD結(jié)構(gòu)，作者們進行了光電聯(lián)合成像，并確認在冷凍電鏡下采集的其中一類為抑制性突觸的PSD結(jié)構(gòu)。

　　在觀察這些tomogram數(shù)據(jù)的時候，作者們發(fā)現(xiàn)大量的五聚體密度，疑似為GABAAR。于是項目解析目標進一步明確為解析GABAAR的原位結(jié)構(gòu)與分布。為準確找到這些GABAAR，作者們對PSD所在的突觸后膜進行了細胞膜的建模以確認細胞膜的取向。隨后，他們在膜的模型上種下“種子”，并保證這些種子的數(shù)量遠遠超過GABAAR的數(shù)量，通過這種過采樣方法，絕大多數(shù)GABAAR有望被找到。接著，作者們使用Relion對圍繞這些種子切下的子斷層圖像進行了仔細的分類和對齊計算，再利用膜的已知幾何特征，對重疊或計算失誤的子斷層圖像進行清除，并最終獲得GABAAR的19分辨率原位結(jié)構(gòu)。通過對一系列已知GABAAR體外重組結(jié)構(gòu)的比對，該cryo-ET結(jié)構(gòu)被認為和GABAAR-b3的結(jié)構(gòu)【6】最為近似。

　　在獲得原位結(jié)構(gòu)后，作者們進一步對GABAAR在PSD的原位分布進行了分析。在計算GABAAR的相對位置后，鄰近的GABAAR被發(fā)現(xiàn)以11 nm的典型距離間隔。并以GABAAR pair為基本單元組裝成較為松散的網(wǎng)絡(luò)分布在PSD上，并呈現(xiàn)分明的邊界。作者們進一步推斷，這些GABAAR形成的網(wǎng)絡(luò)可能與突觸后的支架蛋白及其他受體有相互作用，并與突觸前的囊泡釋放位點對齊。

　　GABA受體的結(jié)構(gòu)一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和膜蛋白研究的熱點。自2014年使用晶體學(xué)解析首個GABAAR結(jié)構(gòu)，到當年迎來的冷凍電鏡革命推動整個GABAAR結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域向冷凍電鏡轉(zhuǎn)型，到如今畢國強團隊與周正洪團隊結(jié)合冷凍電鏡斷層成像技術(shù)（cryo-ET）及子斷層圖像平均法（STA）揭示其原位結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)的更新與發(fā)展趨勢，從這6年間發(fā)表的GABAAR結(jié)構(gòu)歷程中可見一斑。當結(jié)構(gòu)生物學(xué)屆不再僅僅滿足于體外重組蛋白的高分辨信息，而更渴望獲得它們在原生環(huán)境下的全長天然結(jié)構(gòu)及地理分布時，cryo-ET及STA 成為回答這些問題的主要高分辨手段。cryo-ET被應(yīng)用在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中，可以回答很多獨一無二的生物學(xué)問題，在筆者看來最吸引人的有四個：1）它帶來豐富的、納米級分辨率的生物背景(context)。比如生物大分子在原生環(huán)境中的拷貝數(shù)、分布規(guī)律、與其他分子的互作；2）它展示天然、原位的生物結(jié)構(gòu)；3）它的三維原始數(shù)據(jù)特點為解析在體外難以重組表達的超大分子復(fù)合物帶來可能；4）結(jié)合光電聯(lián)合、聚焦離子束減薄等技術(shù)，它可以實現(xiàn)跨尺度高分辨成像，甚至可以從生物組織中獲得納米級分辨率三維信息。由于應(yīng)用前景廣闊，可拓展空間巨大，cryo-ET被譽為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的未來技術(shù)方向。然而，該方向技術(shù)分支較多、學(xué)習(xí)路線漫長、眾多軟硬件不夠成熟，讓眾多即使有冷凍電鏡積淀的初學(xué)者也淺嘗輒止、望而卻步。這篇文章的方法討論部分篇幅詳細，解答的生物問題新穎性較強，這展示著，畢國強團隊與周正洪團隊可謂是當之無愧的結(jié)構(gòu)生物學(xué)先驅(qū)者。